摘要: 目的 优化氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)联合葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)造模结肠炎相关性结肠癌( colitis-associated colorectal cancer,CAC) 方法并探究肠道菌群在 CAC 中的发病机制。 方法通过 AOM 不同注射次数联合自由饮用 DSS 的方法建立 A(AOM 1 次注射)和 B(AOM 2 次注射)模型组,正常组采用腹腔注射生理盐水联合饮用纯净水,每组 10 只。 造模结束后通过 DAI 评分、结肠长度、成瘤率及死亡率等指标综合评估,选择最佳的造模方案。 然后对 B 模型组小鼠进行实验,取血清以 ELISA 法检测白细胞介素-6( IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及肿瘤标志物 CA199、CEA、CA724 含量;同时进行 HE 染色观察结肠病变;并对小鼠粪便进行 16S rDNA 高通量基因测序法分析,以探究 CAC 小鼠肠道菌群的变化。 结果 单次和加强 AOM 注射联合 DSS均能诱导 CAC 小鼠模型。 但与 A 模型组相比,B 模型组小鼠结肠内增生物较大,排列紧密且形态大小较一致,成瘤率达到 100%。 与正常组相比,B 模型组 IL-6 显著升高(P< 0. 05),TNF-α 含量升高(P> 0. 05);肿瘤标志物除CA724 外,CA199 和 CEA 含量均明显升高(P< 0. 05);HE 病理结肠内炎性细胞的浸润,并伴有管腔表面显示出高级别上皮内肿瘤样改变。 菌群结果显示,与正常组相比,CAC 小鼠肠道菌群物种多样性及丰度降低,疣微菌门和放线菌门增多(P< 0. 05),拟杆菌门和弯曲菌门减少(P< 0. 05)。 阿克曼菌、普雷沃菌、瘤胃球菌、双歧杆菌等显著增多(P< 0. 05);罗氏菌属、Muribaculaceae、理研菌属、厌氧原体属等显著减少(P< 0. 05)。 结论 AOM 2 次注射联合自由饮用 1. 5%(1. 5 g / 100 mL)DSS 诱导的 CAC 模型小鼠结肠成瘤率高、肿瘤形态大小均一、死亡率低,可作为药效学实验评价的优选造模方案。 多种肠道菌群紊乱或功能失调,造成的通透性增高,肠黏膜屏障功能破坏,进而诱发肠源性内毒素释放,导致持续的炎症反应或是诱发 CAC 发病的间接或直接原因。

摘要: 目的 颈椎间盘突出症(cervical disc herniation,CDH)是骨科常见疾病之一,随着对该疾病研究的深入及颈椎内植物的发展,建立颈椎融合动物模型成为不可或缺的部分,目前国内对颈椎融合动物模型建立及评估的研究报道较少,本研究以期为颈椎融合相关研究提供完备的动物模型和内植物性能的评估方案。 方法 选择小尾寒羊,改良术式后行颈椎前路椎间盘切除融合术( anterior cervical discectomy and fusion,ACDF),将聚醚醚酮(polyetheretherketone,PEEK)椎间融合器(interbody fusion cage,Cage)(对照组)、3D 打印钛合金 Cage(实验组 1)及新方法钛合金 Cage(实验组 2)分别植入每只羊的不同颈椎节段(C2 / 3 ~ C4 / 5),术后行血液学检测、组织病理学分析评估手术恢复情况及材料生物安全性,利用 X 光、CT、Micro-CT 及定量分析、硬组织切片染色、生物力学试验评估内植物的骨长入及骨融合情况。 结果 绵羊改良术式 ACDF 模型建立成功,血液学检测重要指标无显著性差异(P> 0. 05), 组织病理学分析显示均无炎症细胞浸润等病理改变,内植物生物安全性良好,X 光及 CT 显示内固定位置及椎间融合情况良好,术后 3 个月及 6 个月 Micro-CT 及定量分析表明,与 PEEK Cage 组相比,新方法钛合金Cage 组及 3D 打印钛合金 Cage 组内部的骨体积/ 总体积、骨小梁数目显著性升高(P< 0. 01),骨小梁间距显著性降低(P< 0. 01), 且新方法钛合金 Cage 组骨质长入更多(P< 0. 01),硬组织切片染色表明新方法钛合金 Cage 组及3D 打印钛合金 Cage 组孔隙内有明显骨质长入且较为密实,结合较 PEEK Cage 组略好,生物力学试验显示,与PEEK Cage 组相比,新方法钛合金 Cage 及 3D 打印钛合金 Cage 在一定程度上降低了颈椎屈伸、侧弯、扭转运动范围(P< 0. 05), 同时增强了颈椎的稳定性,且新方法钛合金 Cage 更有优势(P< 0. 05)。 结论 建立绵羊改良术式ACDF 模型后,利用合理有效的评估方法,证明了该模型的合理性及有效性,同时说明 3 种材料的 Cage 均显示出良好的生物安全性,新方法钛合金 Cage 及 3D 打印钛合金 Cage 较 PEEK Cage 的骨长入及骨融合性能更强,可增强颈椎的稳定性,且新方法钛合金 Cage 更有优势。

摘要: 目的 比较 3 种不同方案制备的动物模型,探索稳定、可靠且重复性好的小鼠慢性心力衰竭模型。 方法 将 25 只雄性 C57BL/ 6J 小鼠随机分为 4 组:正常组(ZC 组)、实验 A 组(MA 组)、B 组(MB 组)和 C 组(MC组)。 实验组采取不同制备方案连续注射 ISO,其中 MA 组和 MB 组为浓度递减造模法,MA 组(第 1 天 10 mg / kg、第2 天 5 mg / kg、第 3 ~ 30 天 2. 5 mg / (kg·d);皮下注射 30 d);MB 组(第 1 天 20 mg / kg、第 2 天 10 mg / kg、第 3 ~ 14 天5 mg / (kg·d);皮下注射 14 d);MC 组(浓度恒定 7. 5 mg / (kg·d),腹腔注射 28 d),构建慢性心衰动物模型。 在注射结束后的第 2 天,计算各组小鼠存活率和成模率情况。 通过心脏超声检测心功能,并用 ELISA 测定血清中 NT-pro BNP、IL-6、TNF-α 水平。 结果 在第 30 天注射结束后,各实验组虽都能有效诱导慢性心力衰竭,但发现 7. 5 mg / kg浓度 MC 组的造模情况最稳定,更适合后续开展中医药相关的心衰研究。 结论 ISO 制备小鼠慢性心衰模型以恒定 7. 5 mg / (kg·d),连续腹腔注射 28 d 为最佳方案。

摘要: 目的 采用不同浓度 DSS 及给药时间诱导 NLRP3P>- / -P> 小鼠溃疡性结肠炎( ulcerative colitis, UC)模型,并分析与评价其优劣性,为 UC 发病机制的研究和治疗药物研发提供更贴切临床的动物模型。 方法 SPF 级 48只雄性 NLRP3P>- / -P>小鼠随机分组,每组 12 只小鼠(空白组、2. 5% 7 d 组、3% 7 d 组和 3% 5 d 组),采用不同浓度 DSS和给药时间相结合诱导 UC 小鼠模型,观察和评价小鼠的体重、DAI 评分、HE 染色、结肠长度及相关指标( IL-6、TNF-α 和紧密连接蛋白(ZO-1))的表达水平评价造模的效果。 结果 (1)DSS 各小组在不同浓度及给药时间均能诱导 UC 模型;(2)随着浓度梯度增加及给药时间延长,NLRP3P>- / -P>小鼠的体重减轻越显著、粪便潜血呈阳性越明显、DAI 评分越高,甚者出现死亡;(3)经 HE 染色发现,NLRP3P>- / -P>小鼠肠黏膜屏障组织病理损伤随 DSS 给药时间增长或浓度增高而加重;(4)采用免疫组织化学方法检测炎症因子及紧密连接蛋白,相对于空白组、模型组的炎症因子(TNF-α 及 IL-6)的表达水平均有所升高,而紧密连接蛋白水平表达( ZO-1) 较空白组有所降低。 结论 ( 1)NLRP3P>- / -P>小鼠在 2. 5% DSS 7 d、 3% DSS 7 d 和 3% DSS 5 d 条件下均可诱导 UC 模型;(2)结合 DAI 评分、HE 染色和相关指标检测以及小鼠生存率,NLRP3P>- / -P>小鼠在 3% DSS 5 d 条件下诱导 UC 模型更贴切 UC 临床表现,更有利于后期药物干预。

摘要: 目的 本研究拟从宿主-肠道菌群-代谢的角度探讨泻白散保护过敏性哮喘大鼠可能的微观机制。 方法 将 SPF 级 SD 大鼠分为正常对照组(NC 组)、过敏性哮喘模型组(M 组)和泻白散组(Xiebaisan 组)。 通过卵清白蛋白(OVA)诱导建立大鼠过敏性哮喘模型;HE 染色观察大鼠肺组织病理学变化;取结肠内容物进行 16S rDNA 高通量测序,观察肠道菌群结构与功能的变化;采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱法(UHPLCQ-TOF/ MS)分别进行血清样本和肺组织样本非靶向代谢组学检测。 结果 HE 染色显示:与 NC 组相比,Xiebaisan组可以在一定程度上改善哮喘大鼠肺部组织形态结构;16S rDNA 高通量测序结果显示:M 组肠道菌群多样性降低,与 M 组相比,Xiebaisan 组肠道菌群多样性增加,肠道微生态得以改善;血清非靶向代谢组学检测结果显示:Xiebaisan 组能够调节氨基酸代谢、mTOR 等通路,且部分回调 M 组引起的差异代谢物表达;肺组织样本非靶向代谢组学检测结果显示,Xiebaisan 组能够调节碳代谢、血管平滑肌收缩信号通路和 cAMP 等信号通路,且部分回调 M 组引起的差异代谢物表达。 结论 泻白散可能通过改善肺组织形态结构、肠道菌群的多样性以及调控 mTOR 通路、血管平滑肌收缩信号通路和 cAMP 等信号通路影响氨基酸代谢、碳代谢等途径发挥对过敏性哮喘大鼠的保护作用。

摘要: 目的 结合社会心理应激导致炎症性肠病、肠易激综合征等一系列疾病的特点,建立实验性慢性束缚小鼠肠道应激损伤模型,为探讨慢性束缚应激诱导胃肠病的致病机制以及防治措施奠定基础。 方法 18 只雄性SPF 级 BALB/ c 小鼠,适应 7 d 后,根据体重按随机数字表法分为 2 组,对照组及慢性束缚应激组。 对小鼠进行束缚应激,每天 3 h,连续束缚 14 d,建立肠道损伤模型。 通过观察体重、肠道组织病理形态变化、检测紧密连接蛋白表达、肠上皮细胞凋亡以及炎症细胞因子 mRNA 表达水平等指标对模型进行评价。 结果 慢性束缚应激 14 d,小鼠表现为体重减轻,十二指肠绒毛高度变短、隐窝结构异常、绒毛/ 隐窝比下降;结肠黏膜炎性细胞浸润、隐窝结构不规则。 蛋白免疫印迹、免疫组化和免疫荧光染色结果显示,慢性束缚应激后小鼠十二指肠和结肠紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1 表达显著下降( P< 0. 05);肠上皮细胞凋亡蛋白 Cleaved-Caspase-3 的表达显著增加( P<0. 05)。 此外,肠道炎症因子和趋化因子 mRNA 表达结果显示,慢性束缚应激 14 d 显著提高了小鼠十二指肠 IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-10 基因的表达(P< 0. 05);慢性束缚应激 14 d 显著提高了小鼠结肠 IL-1β、IL-6、MCP-1 的表达(P< 0. 001)。 结论 利用小鼠行为限制装置对小鼠连续束缚 14 d,导致应激小鼠肠道组织结构异常、肠屏障功能障碍、肠上皮细胞凋亡,引发肠道炎症反应,表明慢性束缚应激肠道损伤小鼠模型构建成功。

摘要: 目的 利用簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR) / Cas9 基因编辑系统构建质粒并敲除裸鼹鼠皮肤成纤维(NMR skin fibroblasts,NSF)细胞 HIF-1α 基因,为研究裸鼹鼠的耐低氧机制及缺氧相关疾病的发生发展机制提供体外细胞模型。 方法 针对裸鼹鼠 HIF-1α 基因的 1 ~ 4 号外显子区域设计 4 对 sgRNA 序列,并成功构建表达质粒。 筛选得到最优 sgRNA 后,转染 HEK-293T 细胞收集上清液测定病毒滴度。 前期用 pLenti-Cas9( blast)病毒感染 NSF 细胞,后用制备的 HIF-1α-sgRNA 病毒感染表达 Cas9 蛋白的 NSF 细胞。 经药筛后观察荧光表达,同时提取细胞 gDNA 和蛋白。 通过 T7E1 酶和 Western Blot 检测 NSF 细胞中 HIF-1α 基因变化及蛋白表达情况。 结果Sanger 测序显示,所设计的 sgRNA 成功插入到 pX459 和 pKLV2-U6-sgRNA2 载体上,序列验证正确,重组质粒构建成功;T7E1 酶切实验成功切除 3 条带,sgRNA 的打靶效率为 54%,Western Blot 结果表明,经药筛后的裸鼹鼠 NSF细胞 HIF-1α 基因敲除成功,蛋白水平显著降低(p= 0. 0019);且未发现 HIF-1α 敲除细胞形态的明显变化,基因敲除对细胞增殖能力无明显影响。 结论 成功构建靶向裸鼹鼠 HIF-1α 基因的 CRISPR/ Cas9 质粒,且质粒靶向敲除HIF-1α 基因功能验证成功,将有利于裸鼹鼠耐低氧机制研究,并为人类缺氧相关疾病防治提供理论依据。

摘要: 目的 探讨 WNK2 对肝细胞癌(hepatocellocellua carcinoma, HCC)中 ERK1 / 2 / ROS / SHP2 信号通路的影响,并探讨其在 HCC 细胞增殖和迁移中的作用。 方法 将 WNK2-mimic 和 sh-RNA WNK2 以及相应的阴性对照转染 HepG2 细胞,采用 BALB/ c 裸鼠皮下成瘤实验检测 WNK2 对肝细胞癌增殖能力的影响;采用 Western Blot 检测瘤组织中 WNK2、p40、gp90、p-SHP2、p-AKT 和 p-ERK1 / 2 的表达;使用 SHP2 抑制剂 PHPS1 进行处理之后,采用Western Blot 检测 HepG2 细胞中 WNK2、 p40、 gp90、 p-SHP2、 p-AKT 和 p-ERK1 / 2 的表达;使用细胞划痕实验和Transwell 检测 HepG2 细胞的迁移能力和侵袭能力;采用单克隆增殖实验和 CCK-8 检测 HepG2 细胞的增殖能力。 结果 与 sh-NC 组相比,sh-RNA WNK2 组裸鼠的瘤体体积显著增大(P< 0. 01);而与 NC-mimic 组相比,WNK2-mimic 组裸鼠的瘤体体积显著减小(P< 0. 01);Western Blot 结果显示,与 sh-NC 组相比,sh-RNA WNK2 组 WNK2 的表达显著降低(P< 0. 01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT 和 p-ERK1 / 2 的表达显著升高(P< 0. 01);而与 NC-mimic 组相比,WNK2-mimic 组 WNK2 的表达显著升高(P< 0. 01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT 和 p-ERK1 / 2 的表达显著降低(P< 0. 01);在体外实验当中,相对于 sh-NC 组,sh-RNA WNK2 组中 WNK2 的表达显著降低(P< 0. 01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT 和 p-ERK1 / 2 的表达显著升高(P< 0. 01);相对于 sh-NC + PHPS1 组,sh-RNA WNK2 + PHPS1 组中WNK2 的表达显著降低(P< 0. 01),而 p40、gp90、p-SHP2、p-AKT 和 p-ERK1 / 2 的表达则被逆转并且与 sh-NC +PHPS1 组不具有显著性差异(P > 0. 05);细胞划痕实验和 Transwell 结果显示,相对于 sh-NC 组,sh-RNA WNK2 组HepG2 细胞的迁移和侵袭能力显著升高(P< 0. 01);sh-NC + PHPS1 组和 sh-RNA WNK2 + PHPS1 组 HepG2 细胞的迁移和侵袭能力显著降低并且不具有显著性差异(P> 0. 05);单克隆增殖实验结果显示,相对于 sh-NC 组,shRNA WNK2 组 HepG2 细胞的增殖能力显著升高(P< 0. 01),而 sh-NC + PHPS1 组和 sh-RNA WNK2 + PHPS1 组HepG2 细胞的增殖能力显著降低并且不具有显著性差异(P> 0. 05)。 结论 WNK2 可以抑制 ERK1 / 2 / ROS / SHP2信号通路,从而抑制 ERK1 / 2 / AKT 信号通路,延缓 HCC 的增殖和迁移。

摘要: 目的 本研究拟通过建立坐骨神经慢性缩窄损伤( chronic constriction injury,CCI)小鼠模型,分析和探讨白芷在神经病理性疼痛中的镇痛效果及其对 MrgprD-TRPA1 信号通路的调控作用。 方法 无菌外科手术结扎缠绕 30 只小鼠坐骨神经制备 CCI 小鼠模型;VonFrey 实验检测白芷对小鼠机械刺激疼痛行为学变化,热辐射实验评估白芷对小鼠热痛觉过敏情况;Western Blot、免疫荧光、RT-PCR 检测白芷对小鼠 MrgprD 和 TRPA1 蛋白表达水平、DRG 阳性神经元数量、MrgprD 和 TRPA1 mRNA 水平的影响;通过对 HEK293 细胞分别单转染和共转染 MrgprD、TRPA1 质粒后的钙成像实验,分析荧光信号强度差异性。 结果 共成功制备了 25 只 CCI 小鼠模型,造模率达到83. 33%(25 / 30);白芷灌胃的 CCI 小鼠机械性阈值和缩足潜伏时间均显著大于对照组(P< 0. 05);白芷灌胃的 CCI小鼠中 MrgprD 和 TRPA1 蛋白表达水平均显著低于对照组(P< 0. 05);白芷灌胃的 CCI 小鼠 DRG 中 MrgprD 和TRPA1 阳性神经元的数量显著低于对照组(P< 0. 05);白芷灌胃的 CCI 小鼠中 MrgprD 和 TRPA1 mRNA 相对表达水平均显著低于对照组(P< 0. 05);共转染 MrgprD 和 TRPA1 质粒的 HEK293 细胞中荧光强度显著高于单转染和对照组(P< 0. 05)。 结论 本研究通过探究白芷在 CCI 小鼠模型中镇痛的效果,证明了 MrgprD-TRPA1 是神经病理性疼痛的重要作用靶点,揭示了白芷可以通过调控 MrgprD-TRPA1 信号转导通路来抑制神经病理性疼痛程度,这为后续开发新型临床镇痛药物及镇痛机制的深入研究奠定了基础。

摘要: 目的 探讨脓毒症病程中凝血功能和炎症水平的改变。 方法 通过改良盲肠结扎穿刺术( cecal ligation and puncture,CLP)构建复合感染脓毒症大鼠模型(multiple infection sepsis model,MIM),将 48 只雄性 SD 大鼠随机分为空白组(Control 组,n= 8)、假手术组(Sham 组,n= 8)、复合感染脓毒症模型 4 h(4 h 组,n= 8)、8 h(8 h 组,n= 8)、12 h(12 h 组,n= 8)、16 h(16 h 组,n= 8)组,检测炎症指标和凝血相关指标。 结果 (1)所有脓毒症模型大鼠脂多糖( lipopolysaccharide,LPS) 及白介素-6 ( interleukin-6, IL-6) 含量较 Sham 组均显著升高( P<0. 001),且术后随时间延长,LPS 及 IL-6 含量逐渐升高,12 h 后 LPS 无明显变化;(2)脓毒症模型病程中后期组(8 h及以后)凝血酶原时间(prothrombin time,PT)较 Sham 组明显延长(P< 0. 01);(3)与 Sham 组相比,8 h 组、12 h 组、16 h 组活化部分凝血酶原时间(activated partial thromboplastin time,APTT)时间显著延长(P< 0. 05,P< 0. 01),且8 h 后 APTT 逐渐延长接近 Control 组;(4)8 h 后(不含 8 h)纤维蛋白原(fibrinogen,Fbg)含量较 Sham 组显著增加(P< 0. 01);(5)脓毒症病程各时间段组均与 Control 组纤维蛋白降解产物( fibrin degradation products,FDP)具有显著性差异(P< 0. 01),而与 Sham 组无显著性差异;(6)脓毒症病程各时间段组抗凝血酶-Ⅲ( antithrombin-Ⅲ,AT-Ⅲ)较 Sham 组均显著降低(P< 0. 01),且 AT-Ⅲ随病程呈下降趋势,其中 4 h 组及 8 h 组与 16 h 组比存在显著性差异。 结论 MIM 大鼠模型可较好地反映脓毒症病程中炎症与凝血紊乱的发展趋势与相互关系,可更好的为探究脓毒症病程发展提供研究基础。

摘要:肠易激综合征( irritable bowel syndrome,IBS)是常见的功能性肠病之一,其中腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant IBS,IBS-D)占比最多,发病机制复杂多样,且缺少临床特效药。 动物模型的制备是进一步研究疾病机制、评价临床药效以及药物开发的重要基础,而模型制备和评价标准关乎研究的质量。 本文通过查阅国内外文献及结合本课题组的前期建模经验,基于 IBS-D 目前公认的发病机制出发,从腹泻情况观察,内脏敏感性测定,肠道动力测定等方面系统总结 IBS-D 动物模型的评价方法以期为今后研究提供参考。

摘要:鸽子具有集群和归巢习性,善于远途负重与持续飞行,导航和空间认知能力卓越,近年来被广泛应用于动物机器人研究。 鸽子机器人通过对鸽子脑内特定的神经靶点施加神经信息干预以实现运动行为控制。 本文根据鸽脑内的分层多级神经调控靶点分布,分别对基于感觉系统、动机和情绪系统或皮层以及中脑运动区的鸽子机器人研究进展进行分类综述,以期为进一步利用鸽子机器人开展空间感知、侦察勘测和反恐搜救等应用研究提供参考和指导。

摘要:卵巢储备功能减退(diminished ovarian reserve,DOR)由于女性卵巢内剩余的卵母细胞数量和/ 或质量下降,导致卵巢功能减退,是卵巢功能下降的早期阶段,包括与高龄相关的生理性 DOR 和病理因素导致的病理性 DOR。 DOR 可进展为早发性卵巢功能不全、卵巢早衰,对女性健康产生深远影响,而目前仍无有效方法逆转卵巢功能衰退。 人类卵巢资源的有限性和医学伦理的要求,使得必须通过建立合适的动物模型去探究卵巢功能衰退的分子机制,寻找其预测及治疗靶点。 本文总结目前常用的 DOR 啮齿类动物造模方法为相关基础研究提供参考。

摘要:5 × FAD 转基因小鼠(transgenic mice with five familial Alzheimer’ s disease)是携带 5 个家族性基因突变的 APP / PS1 转基因小鼠,其中与 β-淀粉样蛋白前体( amyloid precursor protein,APP) 相关的突变为 K670N/M671L(Swedish)、1716V(Florida)和 V7171(London),与早老素-1(presenilin 1,PS1)相关的突变为 MI46L 和 L286V。5 × FAD 小鼠在 1. 5 月龄时脑内已有大量的 β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ),2 月龄时开始出现神经炎性斑( neuritic plaque,NP)。 5 × FAD 小鼠的病理表型包括淀粉样斑块聚集、神经元丢失、神经胶质细胞增生和记忆功能障碍等。5 × FAD 小鼠的生物学特性可能涉及脑内 Aβ 斑块的形成变化、Tau 蛋白过度磷酸化、突触功能障碍、神经炎症反应、线粒体功能障碍、血脑屏障损伤、神经元损伤、内质网应激和眼部病变等。 作为阿尔茨海默病的经典动物模型,5 × FAD 转基因小鼠在早期即可模拟 AD 患者晚期的神经病理过程及行为学表现,被广泛应用于 AD 发病机制研究和 AD 新药开发。 本文对 5 × FAD 转基因小鼠模型的模型构建、生物学背景、生物学特性及 AD 防治药物的研发应用进行总结,以期为 5 × FAD 转基因小鼠在 AD 研究中的应用提供参考与借鉴作用。