目的制备小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）标准血清，建立ELISA检测方法，实现一种病毒多种检测方法的比对研究。方法用TMEV感染3周龄SPF级BALB／c小鼠，制备免疫用抗原。分别在0、7、14d以腹腔注射的方式免疫SPF级6-8周龄BALB／c小鼠，免疫血清用IFA、IEA法进行鉴定；TMEV感染BHK-21细胞，制备EHSA抗原，确定酶结合物、抗原和标准阳性血清的最佳工作浓度，建立TMEVEHSA检测方法，进行敏感性、特异性、重复性和稳定性实验。结果制备TMEV免疫血清，以IFA、IEA测定血清效价分别为1：640和1：320，与痘苗病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠肝炎病毒、仙台病毒和呼肠孤病毒-Ⅲ型均无交叉反应；建立了ELISA检测方法，确立了各种试剂的最佳工作浓度，其中酶结合物最佳工作浓度为1：10000，抗原为2.5μg／mL，阳性参考血清为1：200；EHSA检测灵敏度为1：3200。板内特异抗原、正常抗原平均变异系数为4.67％和5.7％，板间为4.39％和7.61％。稳定性实验相对偏差均小于20％。结论本研究制备的TMEV免疫血清可作为血清学检测方法中的标准质控血清；建立的ELISA方法重复性、稳定性好，敏感性和特异性强，可用于小鼠脑脊髓炎病毒血清抗体检测。