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首页 > 过刊浏览>2019年第29卷第5期 >44-50. DOI:10.3969/j. issn. 1671 -7856. 2019. 05. 007
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CRISPR/ Cas9 系统介导Slc6a6 基因敲除大鼠的繁殖与鉴定
作者:
作者单位:

(1. 天津医科大学,天津 300070;2. 天津市环湖医院,天津市神经外科研究所,天津市脑血管与神经变性重点实验室,天津 300350)

中图分类号:

R-33


Reproduction and identification of Slc6a6 knockout rats mediated by the CRISPR / Cas9 system
Author:
Affiliation:

(1. Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China. 2. Tianjin Huanhu Hospital, Neurosurgery Institute of Tianjin,Tianjin Key Laboratory of Cerebrovascular and Neurodegenerative Diseases, Tianjin 300350)

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    摘要:

    目的 利用CRISPR/ Cas9 技术构建牛磺酸转运体基因(solute carrier family 6 member 6,Slc6a6)敲除大鼠,繁殖并鉴定,为研究牛磺酸缺失对神经系统疾病的影响提供稳定的大鼠模型?方法 针对Slc6a6 基因第5外显子,设计向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)介导Cas9 核酸酶与靶点DNA 特异性结合,并切割基因组DNA,被切割后的DNA 进行重组修复,从而实现基因的敲除?通过基因型鉴定和测序分析检测新生大鼠基因型?利用Real-time PCR?Western blot 技术和免疫组化等方法,分析大鼠脑组织的牛磺酸转运体(taurine transporter,TauT)的mRNA 表达和蛋白表达,建立Slc6a6 基因敲除大鼠模型?结果 F3 代出现21 只Slc6a6 基因敲除纯合子(TauT-/ - ),54 只杂合子(TauT+/ - ),27 只阴性(TauT+/ + ),F3 代纯合率约为20. 59%,基本符合孟德尔遗传定律?Slc6a6 基因敲除纯合子大鼠脑组织mRNA 水平基本不表达,TauT 蛋白表达水平显著低于同窝阴性大鼠?结论 本研究利用CRISPR/ Cas9 系统定向敲除Slc6a6 基因,成功构建Slc6a6 基因敲除大鼠模型?

    Abstract:

    Objective CRISPR/ Cas9 technology was used to construct a taurine transporter gene (solute carrierfamily 6 member 6, Slc6a6) knockout rat, which was used as a stable animal model to study the effects of taurine onneurological diseases. Methods For exon 5 of the Slc6a6 gene, a single-guide RNA (sgRNA) mediated the specificbinding of Cas9 nuclease to the target DNA and cleaved the genomic DNA, which underwent recombinant repair to generatethe gene knockout. Newborn rat genotypes were detected by genotyping and sequencing analysis. The mRNA expression andprotein expression of TauT in rat brain tissues were analyzed by real-time PCR, Western blot and immunohistochemistry.The homozygous Slc6a6 knockout rat was screened out. Results The F3 progeny had 21 Slc6a6 knockout homozygotes(TauT-/ - ), 54 heterozygous (TauT+/ - ) and 27 wild-types (TauT+/ + ). The homozygosity rate was about 20. 59% in the F3generation. The offspring showed a normal Mendelian ratio. No Slc6a6 mRNA was observed in brain tissues from Slc6a6knockout homozygous rats and the expression level of TauT protein was significantly lower than that of littermate-negativerats. Conclusions In this study, the CRISPR/ Cas9 system is used to knockout the exon of the Slc6a6 gene, and the Slc6a6 knockout rat model is successfully constructed.

    参考文献
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    引证文献
引用本文

仝慧慧,齐浩铭,王辰,莫丽冬,范维佳,徐立霞,么秀华,夏一鸣,黄慧玲. CRISPR/ Cas9 系统介导Slc6a6 基因敲除大鼠的繁殖与鉴定[J].中国比较医学杂志,2019,29(5):44~50.

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  • 收稿日期:2019-01-17
  • 在线发布日期: 2019-06-05
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