摘要:目的 供体的短缺是器官移植所面临的主要问题,制备人源化器官是解决此问题的有效途径之一?缺乏延胡索酸乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase, FAH) 会引起遗传性酪氨酸血症Ⅰ型(hereditarytyrosinemia typeⅠ, HTⅠ),致使患者肝细胞凋亡,呈现出肝损伤?对猪(Sus scrofa)进行基因编辑,建立 FAH 基因敲除巴马小型猪,结合人干细胞将有利于人源化干细胞肝的制备?本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1, 3-galactosyltransferase, GGTA1) 敲除巴马小型猪的基础上,通过CRISPR/ Cas9 技术制备 FAH 基因敲除( FAH+/ - ? FAH-/ - )小型猪,并分析其健康与繁育状况?方法 针对猪 FAH 基因设计单链导向RNA (single guide RNA,sgRNA)构建pX330 表达载体转染巴马小型猪耳成纤维细胞(ear fibroblasts of Bama minipigs, BMEF)并进行敲除效率验证,鉴定后选择阳性细胞作为核供体,通过体细胞核移植技术制备 FAH 基因敲除巴马小型猪?提取仔猪的基因组DNA,经PCR 测序后得到突变类型;采集5 月龄 FAH+/ -巴马小型猪血液,检测其血生化与血常规指标并观察肝组织学染色切片;当 FAH+/ -巴马小型猪公猪性成熟后,与野生型(wild type, WT)母猪配种,以其产仔数评价繁育能力状况?结果 得到了 FAH+/ -巴马小型猪,Western blot 显示 FAH+/ -巴马小型猪的肝和肾中 FAH 的表达量均有所下降; FAH+/ -猪与野生型相比, FAH+/ -猪血液理化指标无显著差异;组织学切片染色发现 FAH+/ - 猪肝组织形态出现空泡样变化;与 FAH+/ -公猪配种的野生母猪产仔数正常; FAH+/ - 猪具有正常的健康状况和繁育能力?结论 本研究制备出了 FAH 单基因敲除小型猪,健康状况及繁育能力正常,该单基因敲除猪为将来制备出双等位基因敲除猪与人源化肝的研究提供了良好基础?